موضوع : بررسی نحوه تولید و سم زدایی آفلاترکیسن

توضیح: این فایل به صورت ورد و آماده ی پرینت می باشد

مقدمه
آفلاتوكسين‌ها گروهي از مايكوتوكسين‌ها با قدرت سرطان‌زايي، جهش‌زايي و كاهش كارآيي سيستم ايمني، مي‌باشند (Eatan &Gallagher , 1294; IARC , 1993)  آنها از متابوليت‌هاي ثانويه سنتز شده توسط سويه هاي سم‌زاي ASpergillus flavus , Aspergillus parasiticvs و Aspergillus nomius مي‌باشند. آفلاتوكسين B1 با توجه به پتانسيل بالاتري كه دارد، بيشتر مورد توجه قرار دارد. رشد قارچهاي مولد سم وآلوده شدن به آفلاتوكسين در بسياري از محصولات غذايي ديده مي‌شود (Wood , 1989). در صورت مصرف غذاهاي آلوده به سموم آفلاتوكسين B1¬ و B2، اين سموم به‌آفلاتوكسين‌هاي M1 و M2 متابوليزه مي‌شوند و به درون بافت‌هاومايعات بيولوژيكي و شير حيوانات شيرده ترشح مي‌شوند (Zarba etal , 1992).
سويه‌هاي گونه‌هاي Bifidiobacterium , Lactobacillus , Lactococcus در توليد محصولات شيري تخميري به عنوان استارتر كالچر و توليد كننده طعم و بو، به كار مي‌روند نقش اصلي اين كشت‌ها توليد اسيدهاي آلي مثل اسيدلاكتيك در طي مراحل تخمير است كه سبب افزايش عمر قفسه‌اي محصولات مي‌شود و هم محتويات حساس آنها را تغيير مي‌دهد.
اگر شير به آفلاتوكسين‌ آلوده باشد، احتمال تخريب مرحله تخمير و توليد تركيباتي با بوي تغيير يافته و ناخواسته را در محصول ايجاد مي‌كند (Sutic & Banina , 1990).
اخيراً EL – Nezami  و همكارانش (1996 , 1998) گزارشاتي ارائه داده‌اند مبني بر وجود سويه‌هاي خاص لاكتوباسيل‌ كه توانسته‌اند آفلاتوكسين‌ها را از محلول آبي جداكنند. به علاوه سويه‌هاي خاصي از باكتري‌هاي اسيد لاكتيك، توانسته‌اند آفلاتوكسين M1 را از شير آلوده هم جداكنند (Pierides etal . ;2000). جداسازي آفلاتوكسين در نتيجه اتصال فيزيكي سم به ديواره سلولي يا تركيبات ديواره سلولي است    (Haskard et al. 2000 ; EL- Nezami et al. 1998 b).
همچنين جداسازي بعضي متابوليت‌هاي ضدقارچي مثل دي‌پپتيهدهاي حلقوي و فنيل‌لاكتيك اسيد و اسيدهاي چرب هيدوركسيله شده از باكتري‌هاي اسيدلاكتيك، توانايي اين گونه‌ها در بازدارندگي رشد قارچ‌هاي فاسد كننده مواد غذايي و مواد سم‌آفلاتوكسين را نشان مي‌دهد.
آفلاتوكسين در ذرت
متابوليتهاي سمي توليد شده توسط قارچها، كه به عنوان مايكوتوكسين شناخته مي‌شوند، در طي چند سال اخير بسيار مورد توجه واقع شده‌اند. مايكوتوكسين‌ها امروزه به عنوان تهديد كننده‌هاي سلامتي در حيوانات شناخته شده‌اند كه بيماري‌هايي مثل equine leukoencephalo malaci  در اسب‌ها و Porcine edema را در خوك‌ها ايجاد مي‌كنند. كاهش وزن، كاهش باروري و كاهش مقاومت در برابر بيماريها و حتي مرگ را به مايكوتوكسين نسبت داده‌اند. هيچ حيواني نسبت به آنها مقاوم نيست ولي به طور كلي حيوانات پيرتر مقاوم‌تر از حيوانات جوان هستند. بعضي مايكوتوكسين‌ها، مثل آفلاتوكسين در سلامتي‌اشان هم مخاطراتي را ايجاد مي‌كنند. اين مايكوتوكسين به عنوان يك موتاژن شناخته شده است. شناسايي آفلاتوكسين در ذرت مي‌تواند باعث كاهش قيمت آن جهت بذر و يا حتي معدوم ساختن آن شود. آلودگي با مايكوتوكسين ها ارتباط مستقيم با تاثيرات جوي دارد.
قارچ Aspergillus Flavus توليد كننده آفلاتوكسين در محصولاتي مثل ذرت، پنبه‌دانه و بادام زميني است. قارچ به طور معمول در طبيعت وجود دارد، اما مقدار آن در هواي گرم و خشك افزايش مي‌يابد. آلودگي آفلاتوكسين در ذرت‌هايي بيشتر است كه تحت شرايط استرس توليد شده‌اند. بنابراين، خشكي، گرما، حشرات، كرم‌ها و استرس‌ ناشي از باروركنندگي همگي منجر به ايجاد مقادير بالاي آفلاتوكسين در گياه مي‌شوند. تلاش براي ايجاد هيبريدهاي ذرتي كه به آلودگي قارچي مقاوم باشند و سم را در خود انباشته نكنند، وجود دارد، با وجود اين هيبريدها بسيار مقاوم هستند ولي از تجمع سم به طور كلي نمي توان جلوگيري كرد. با كاهش استرس و مراقبت از حمله حشرات مي‌توان در مقدار آفلاتوكسين كاهش ايجاد كرد (CAST , 1999) .
دماي Fْ100-80 و رطوبت نسبي %85 (% 20-18 رطوبت در دانه‌ها وجود دارد) شرايطي بهينه براي توليد سم و رشد قارچ است.
از طرف ديگر مصرف‌ اين محصولات به عنوان خوراك دام مي‌تواند سبب ايجاد انواع ديگري از آفلاتوكسين‌ها (M1 , M¬2) در شير حيوانات شود. آلودگي ذرت به عنوان غذاي دام و طيور و نيز ماده اوليه جهت فراهم كردن انواع گسترده‌اي از مواد غذايي و تنقلات، داراي اهميت ويژه‌اي است و كاهش آفلاتوكسين به روشهاي مختلف ضروري مي‌باشد.
محصولات كشاورزي مثل ذرت، علوفه، بنشن، گندم و يونجه را مي‌توان با سيلوكردن نگاهداري كرد. در بسياري از كشورها محصولات سيلويي داراي ارزش غذايي بالاتري به خصوص براي دام‌ها مي‌باشند. در كشورهاي اروپايي مثل هلند، آلمان و دانمارك بيش از %90 محصولات توليدي در سيلوها نگاهداري مي‌شوند. حتي در كشورهايي با شرايط عمومي آب وهوايي مناسب جهت خشك كردن مثل فرانسه و ايتاليا، حدود %50 از محصولات خود را در سيلوها نگاهداري مي كنند. (wilkson et al.1996) . جهت توليد سيلويي با كيفيت بالا نياز به مراحل تخمير ميكروبي مناسب وجود دارد. ميكروارگانيسم‌هاي دخيل در مراحل تخمير سيلوها، علاوه بر افزايش كيفيت غذايي محصول، قادر خواهند بود تا از رشد ميكروارگانيسم‌هاي بيماري‌زا و همچنين قارچ‌هاي مولد توكسين، جلوگيري كنند.
از آنجاييكه سيلوكردن محصولات بر پايه تخميرهاي متنوع اسيد لاكتيكي تحت شرايط بي‌هوازي است، به كار بردن سويه‌هاي باكتريايي توليدكننده اسيدلاكتيك كه در سم‌زدايي و كاهش توليد آفلاتوكسين مؤثر هستند، منطقي‌تر به نظر مي‌رسد. باكتري‌هاي اسيدلاكتيك محيطي و ساپروفيت موجود در محصولات، كربوهيدارتهاي محلول در آب (WSC) موجود در محصولات را به اسيدلاكتيك و نيز مقدار كمي اسيداستيك تخمير مي‌كنند. بر اثر توليد اين اسيدها، PH مواد سيلو شده پايين آمده و رشد ميكروارگانيسم‌هاي فاسدكننده، باز داشته مي‌شود. باكتري‌هاي اسيدلاكتيكي كه عمدتاً در سيلوها يافت مي‌شوند. اعضاي جنسي‌هاي لاكتوبا سيلوس، پديوكوكوس، لوكونوستوك، انتروكوكوس، لاكتوكوكوس و استرپتوكوكوس مي‌باشند. اكثر باكتري‌هاي اسيدلاكتيك موجود در سيلوها، مزوفيل‌اند، يعني در دماي بين Cْ50-5 رشد مي‌كنند كه دماي بهينه رشد آنها بين Cْ40-25 مي‌باشد. آنها PH سيلو را تا 5-4 پايين مي‌آورند كه اين به گونه و شرايط محصول بستگي دارد.
همه باكتري‌هاي اسيدلاكتيكي هوازي هاي اختياري‌ اند اما بعضي شرايط بي‌هوازي را ترجيح مي‌دهند (Holzapfel and schillinger , 1992; Teuber et al. 1992) . جمعيت LAB در فاصله بين دروكردن و سيلو كردن محصول افزايش مي‌يابد، كه اين بر اثر احياء حالت‌هاي تاخيري است و نه اضافه كردن مصنوعي و تلقيح ميكروارگانيسم. محتواي قندي و تركيبات قندي موجود در محصول و مقدار ماده خشك و شرايط اسيدي و اسمزي موجود در سيلو، بر رشد و رقابت باكتري‌هاي اسيد لاكتيك در تخمير سيلويي تأثير مي‌گذارند. فاز تخميري سيلوها در زمانيكه شرايط سيلو بي‌هوازي شود، آغاز مي شود كه اين عمل معمولاً بعد از چند ساعت از سيلوكردن كه اكسيژن اتمسفري موجود در اعضاي گياه و فواصل محصول خارج شد، آغاز مي‌شود و بسته به نوع محصول سيلو شده و شرايط سيلو، براي چند روز تا چند هفته ادامه پيدا مي‌كند. در اين فاز، لاكتو باسيل‌ها ميكروارگانيسم‌هاي غالب سيلو هستند و PH سيلو را با توجه به عمل تخمير خود بين 5-8/3 پايين مي‌آورند.
در فاز سوم كه فاز ثابت مي‌باشد كه در صورت عدم دخول هوا به داخل سيلو، در بعضي مواقع به وجود مي‌آيد. در اين حالت اكثر ميكروارگانيسم‌هاي فاز تخميري كاهش پيدا مي‌كنند و تنها بعضي باكتري‌هاي مقاوم به اسيد كه قادر به توليد پروتئازها و كربوهيدراتازهاي مقاوم به اسيد هستند، مثل lactobacillus buchneri در مقادير كم قادر به رشد خواهند بود.
در فاز چهارم كه به محض قرار گرفتن سيلو در برابر هوا آغاز مي‌شود، اسيد آلي نگاهدارنده توليد شده توسط مخمرها و گاهي نيز باكتري‌هاي اسيد استيك تخريب مي‌شوند و درنتيجه PH بالا مي‌رود و در مرحله بعد ميكروارگانيسم‌هاي فاسد كننده شروع به فعاليت مي‌كنند و قارچ‌هاي توليدكننده توكسين‌ مثل آسپرژيلوس فلاووس در اين مرحله شروع به رشد و توليد سم مي‌كنند (Nout et al, 1993) .
به نظر مي‌رسد كه نگاهداري سيلو در فازهاي 2 و 3 با استفاده از افزودنيها و كاهش اكسيژن در هنگام سيلوكردن محصول، باعث جلوگيري از فساد قارچي و توليد سم خواهد شد.(Ste Fanie J. W. H. Oude Elferin Ketae. 2000) .
خصوصيات بيولوژيكي و مورفولوژيكي Aspergillus Flavus
آسپرژيلوس فلاووس متعلق به جنس آسپرژيلوس است كه دومين گونه متداول بعد از آسپرژيلوس فوميگاتوس مي‌باشد. كلني‌هاي A. flavus  سريع رشد مي‌كنند و قطر كلني آنها به cm 7-6 در 14-10 روز مي‌رسد. رنگ كلني در ابتدا زرد است و سپس به زرد متمايل به سبز يا سبز زيتوني تبديل مي‌شود. كلني‌هاي قديمي سبز تيره مي‌شوند. شكل كلني‌ها صاف است و بعضي داراي چروك‌هاي شعاعي‌اند. پشت كلني بدون رنگ و يا به رنگ كرم است. محيط افتراقي، A. flavus , parasiticus آگار (AFPB)  است كه براي غربالگري و شناسايي گونه‌هاي A. flavus  طراحي شده است. I- Pitt , A.D.Hocking , 1985; H.Govrama , L.B.Bullerman ,1995 A.parasiticus , A. Flavas  در اين محيط با توليد اسپورهاي تيپيك زرد تا سبز زيتوني و پشت كلني نارنجي روشن، متمايز مي‌شوند. (K. B. Raper, (D.I.Fennell,1965) . جزئيات بيشتر را مي توان زير ميكروسكوپ الكتروني اسكنينك (SEM) ديد: كنيديوسپورها بلند هستند (  800 -400) و اغلب ظاهري سخت درست در كنار وزيكول‌هاي كروي دارد (253-24). فيلايدها به شكل پيراموني بلند شده‌اند و در دو رديف قرار دارند و بعضي اوقات تك رديفي هستند؛ شكل سرهاي كنيديال از ستوني تا شعاعي و كروي متغير است؛ طرز قرارگيري فيلايدها بر روي وزيكول شكل سركنيديال را تعيين مي‌كند. قطر آنها بين  65 -10 متغير است (J.I.PiH & A.D.Hocking 1985) كنيدي‌ها از جدايي‌هاي A. flavus صاف تا كمي خشن هستند، در حاليكه كنيدي‌ها از A. Parasiticus  خشن هستند. گونه‌هاي خاصي توليد اسكلروتياي قهوه‌اي مي‌كنند.
گونه‌هاي آسپرژيلوس فلاووس در خاك وجود دارند و طيف وسيعي از محصولات كشاورزي را در مزرعه‌ محل‌هاي نگهداري و نيز در طي فرآوري‌ و توزيع آلوده مي‌كنند. Aspergillus Flavus زيرگونه A. bombycis , A.tamarii, A. nomius, Parasiticus  تنها قارچهايي هستند كه توليد آفلاتوكسين در آنها نشان داده شده است (C. P.Kurtmon, 1987 S. W. peterson, Y.Ito, B.W.Horn, T.Go to 2001; C.W.Hesseltin, B.W.Horn ).
سويه هاي آسپرژيلوس فلاووس داراي انواع غيرسم‌زا و توليد كننده‌هاي آفلاتوكسين (B1 , B2, ) مي‌باشد كه در اين بين A. Flavus   زيرگونه پارازيتيكوس، آفلاتوكسين‌هاي B1, B2, G1, G¬2. (AFG2, AFG1,AFB1, AFB2 ) را توليد مي‌كند و جدايي‌هاي غيرسم‌زايي كه آفلاتوكسين توليد نمي‌كنند در طبيعت نادر است (Du sanee Thanaboripat, Yang Qian, Lliu Ruigian, 2001)
توليد آفلاتوكسين
آفلاتوكسين‌ها گروهي از سم‌ها هستند كه ساختار مولكولي مشابهي دارند. اين توكسين براي اولين بار در سال 1960 وقتي كه مرگ تعداد زيادي از بوقلمون‌هاي انگليسي بر اثر بيماري كبدي روي داد، كشف شد. در آن سال بيش از صدهزار بوقلمون در طول چند ماه از بين رفتند.
(M. J. Carlie, S.C.Watkinson. G.W.Gooday. 2001)  دانشمندان ابتدا اين بيماري جديد را “بيماري X بوقلمون” ناميدند زيرا دليل اصلي آن را نمي‌دانستند. در نهايت معلوم شد كه همه پرندگان آسيب ديده با غذايي كه با آرد بادام زميني آلوده شده تهيه شده بود، تغذيه شده بودند. آزمايش آرد بادام زميني مشكوك، وجود قارچ را به اثبات رساند (E. Moore- landecker , 1996) اصلي‌ترين آلودگي ميكروبي مشاهده شده در آرد بادام زميني، Aspergillus Flavus بود و سم توليد شده توسط آن آفلاتوكسين ناميده شد. تا به امروز، آفلاتوكسين به عنوان مضرترين مايكوتوكسين در دنيا شناخته شده است.
مولكول آفلاتوكسين حاوي هسته كورماين (Courmarin) متصل شده به يك بي‌فوران (bifuran) و يا به يك پنتانون است مثل AFB2 , AFB1 مشتق دي‌هيدرو، يا به يك لاكتون ششي جزئي مثل AFG1 و مشتق آن AFG2 متصل است (P.Sanz , R. Reig and J.Piguers et al. 1989). اين چهار تركيب با رنگ فلورسانسي كه تحت تابش اشعه ماوراء بنفش موج بلند، از خود نشان مي‌دهند از هم متمايز مي‌شوند       . (G Green; Bs blue) Hon(M.F.Dutton & J.G.Heathcote, 1966) تعيين آنها مربوط مي‌شود به حركت نسبي كروماتوگرافي آنها. از بين اين چهار تا، B1 داراي بيشترين غلظت است كه بعد از آن G2 , G1 قرار دارند. آسپرژيلوس فلاووس تنها B1 , B2 را توليد مي‌كند و A.Parasiticus علاوه بر اين متابوليت‌ها، G2 ,G1 را هم توليد مي كند. Dutton & Heathcote مشتق‌هاي همي‌استال G1, B1 را به نام‌هاي B2a و G2a شناسايي كردند (M. F. Dutton , J. G. Heathcote , 1966). مشتق‌هاي 4- هيدروكسيلات اين دو توكسين اخير در ذرت و بادام زميني يافت شده است. مشتق‌هاي AFM1 , AFM2 اول در شير گاوهايي كه با غذاي آلوده به آفلاتوكسين تغذيه شده بودند، ديده شدند. ساير آفلاتوكسين‌هاي كوچك ديگر هم توسط A. flavus در محيط كشت و كبد و نيز احتمالاً در ساير اندام‌ها توليد مي‌شوند. توليد آفلاتوكسين نتيجه تركيبي از محيط و سوبسترا و گونه‌ها است. فاكتورهايي كه بر توليد آفلاتوكسين مؤتراند را مي‌توان به سه گروه تقسيم كرد: فاكتورهاي فيزيكي، غذايي و بيولوژيكي. فاكتورهاي فيزيكي شامل دما، PH، رطوبت، نور، هوادهي و درجه گازهاي اتمسفري مي‌باشد. آفلاتوكسين‌ها بين دماي C ْ12 تا 42 توليد مي‌شوند و دماي بهينه Cْ35-25 است (N. D. Davis , U. L. Diener , 1966). توليد ‎آفلاتوكسين در سيلوهاي ذرت %25 در Cْ30 است و پايين‌ترين رطوبت نسبي براي توليد آفلاتوكسين بين %88 و %83 متفاوت است. حضور CO2 و O2 بر رشد قارچ و توليد آفلاتوكسين اثر مي‌گذارد. وجود %20 CO2 در جو، توليد آفلاتوكسين و رشد قارچ را به طور واضح كم مي‌كند.
كاهش در مقدار O2 جو تا %10 توليد آفلاتوكسين را تحت تأثير قرار مي‌دهد، اما تنها در مقادير O2 كمتر از %1 رشد قارچ و توليد آفلاتوكسين به طور كامل بازداشته مي‌شود (U. L. Diener , N. D. Davis , K. E. landers, 1967). بسياري نشان داده‌اند كه PH اوليه به طور مشخص بر توليد آفلاتوكسين اثر گذار نيست، در حاليكه تحقيقات ديگر نشان داده است كه PH اسيدي ضعيف سبب افزايش توليد آفلاتوكسين مي‌شود و به طور واضح رشد قارچ را تحت تأثير مي‌گذارد (B. Jarvis , 1971). هر كدام از محيط‌هاي آزمايشگاهي و طبيعي، تأثير بارزي بر توليد آفلاتوكسين مي‌گذراند. عموماً منبع‌ كربن ارجح براي توليد آفلاتوكسين، گلوكز، ساكارز يا فروكتوز است. منيزيم و روي براي بيوسنتز آفلاتوكسين ضروري است، اما تركيبي از آهن و كادميوم رشد قارچ و در نتيجه توليد سم را كاهش مي‌دهند.

فهرست مطالب

مقدمه    1
آفلاتوكسين در ذرت    2
خصوصيات بيولوژيكي و مورفولوژيكي Aspergillus Flavus    5
توليد آفلاتوكسين    6
بررسي آفلاتوكسين    9
روشهاي سم زدايي    10
كنترل بيولوژيكي قارچهاي مولدآفلاتو كسين و توليد آفلاتوكسين    11
كاربرد باكتري‌هاي اسيدلاكتيك    12
مقدمه‌اي بر باكتري‌هاي اسيدلاكتيكي    13
تاكسونومي    17
متابوليسم    19
زيستگاه:    20
متابوليت هاي ضد قارچي    21
اسيدهاي آلي :    21
ساير محصولات نهايي توليد شده :    22
مروري بر فعاليت ضد قارچي باكتري هاي اسيد لاكتيكي    23
روش كار    25
سوشهاي باكتريايي و شرايط كشت    25
تخمين غلظت باكتريايي.    26
تعيين منحني رشد باكتري    26
تعيين ميزان كاهش آفلاتوكسين    27
اثر شستشو بربازگشت آفلاتوكسين كاهش يافته    27
تعيين مقدار AEB1 باقي مانده درمايع رويي نمونه ها    28
HPLC    28
سويه هاي قارچي و شرايط كشت    28
بررسي اثر بازدارندگي باكتري اسيد لاكتيك برروي رشد قارچ    29
تهيه ذرت آلوده به اسپور قارچ آفلاتوكسين از:    30
تهيه نمونه هاي ذرت آلوده شده به سم و AFB (تهيه اسپايك)    31
روش استخراج AFB ازذرت    31
استخراج ازنمونه ذرت آلوده به اسپورقارچ:    32
استخراج ازنمونه اسپايك:    33
نحوه استفاده از ستون هاي ايمونوافينيتي (Immunoaffinity):    33
نحوه استخراج AFB1 ازرسوب باكتريايي    33
نتايج  حاصل از كشت باكتري ها و تيمار محلول هاي AFB1 :    34
بررسي ميزان بازدارندگي رشد قارچ توسط lactobacillus phantarum:    37
بررسي ميزان آفلاتوكسين درنمونه هاي ذرت تيمارشده با لاكتوباسيلوس:    37