این مقاله با فرمت Word بوده و قابل ویرایش است همچنین آماده پرینت می باشد
موضوع : مقاله ساخت محلولهای مختلف
اولين مرحله در فرايند تخليص پروتئينها هموژنيزاسيون بافت مورد نظر جهت تهيه عصاره مي باشد تهيه عصاره از يك منبع طبيعي همچون قارچ خوراكي با روشهاي مختلفي قابل انجام است همانگونه كه در شكل پيوست نشان داده شده است خرد كردن سلولها به دو روش عمده صورت مي گيرد روش مكانيكي روش غير مكانيكي در روش مكانيكي عمل خرد نمودن سلولها در دو حالت مايع و يا جامد انجام ميشود در روش مايع استخراج پروتئينها از بافت مورد نظر در محيط مايعي همچون محلول بافر صورت مي گيرد بدين منظور بافت به همراه بافر در مخزن دستگاه هموژنايزر ريخته شده و با ايجاد نيروي مكانيكي در مخزن سلولها خرد مي شوند و به همراه محلول بافر مخلوط همگني را تشكيل مي دهند بدين ترتيب محتويات داخل سلولها از جمله پروتئينها به داخل بافر آزاد مي گردند از آنجائيكه پروتئينها مولكولهاي كم و بيش محلول در آب هستند بخشهاي نامحلول و قطعات خرد نشده و سخت سلولي را مي توان با كمك ته نشين سازي با روش سانتريفوگاسيون از بخش محلول جدا نمود
ممانعت از فعاليت پروتئازهاي سلولي با استفاده از محلول PMSF يكي از مسائل مهم در فرآيند تخليص پروتئينها از بافتهاي زنده حفظ پايداري پروتئين هدف است و مهمترين عاملي كه بر ساختار پروتئينهاي موجود در عصاره آسيب وارد مي كند شكست پروتئوليتيك توسط پروتئازهاي سلولي مي باشد پروتئازها دسته اي از آنزيمها هستند كه فعاليت پروتئازي خود را بر روي ساير آنزيمها و پروتئينها انجام مي دهند از اين رو در مرحله تهيه عصاره لازم است تا با استفاده از يك تركيب ممانعت كننده فعاليت پروتئازها همچون PMSF از اين خطر جلوگيري بعمل آيد PMSF مهار كننده تمامي سرين پروتئاز ها است و با غلظت مؤثر mM11/0 و نيمه عمر يك ساعت قادر است سرين پروتئازها را بطور برگشت ناپذير و سيستئين پروتئازها را با احياي گروه تيول آنها بطور برگشت پذير مهار نمايد سانتريفوگاسيون يكي از روشهاي متداول مورد استفاده در آزمايشات استخراج و تلخيص پروتئينها روش سانتريفوگاسيون مي باشد اين روش بطور كلي به منظور اهداف زير بكار مي رود
جداسازي دو فاز مايع غير قابل اختلاط
بخش بندي اجزاء سلولي همچون اسيدهاي نوكلئيك و پروتئينها
در اين روش ذرات مختلف موجود در محلول تحت تأثير نيروي ميدان سانتريفوگال با سرعتهاي متفاوتي ته نشين مي شوند بطوريكه سرعت ته نشين سازي وابسته به عواملي چون اندازه شكل بار چگالي ذره در مقايسه با محيط سانتريفوگاسيون نارواني محيط و دما است در مرحله جداسازي مقدماتي فرايند تخليص صاف كردن هموژن سلولي در مقادير آزمايشگاهي و بازيافت رسوب محولها با استفاده از دستگاههاي سانتريفوژ يخچالدار با دورهاي متوسط تا بالا صورت مي گيرد سانتريفوژهاي با دور بالا مي توانند سرعتهاي rpm750002000 يا g× 500000g×40000 را تأمين نمايند نيروي لازم جهت ته نشين سازي اجزاء مخلوطها با استفاده از دو كميت rpm و gRCF تعيين مي شود بطوريكه رابطة بين اين دو كميت به قرار زير است
روش تهيه عصاره مقدار 250 گرم قارچ منجمد شده در دماي 20 درجه سانتيگراد توسط رندة برقي دوبار رنده شد تا خمير نرمي بدست آمد اين خمير به يك بشر يك ليتري منتقل گرديد و با ml250 بافر A و 100 ميكروليتر محلول F PMS به مدت 30 دقيقه در درون ظرف يخ خشك در دماي صفر درجة سانتيگراد به آرامي با همزن مغناطيسي مخلوط شد پس از اين مدت مخلوط حاصل به سه ظرف مخصوص سانتريفوژ يخچالدار منتقل شد و با دور rpm14000 به مدت 30 دقيقه در دماي c سانتريفوژ شد مادر آب حاصل يا عصارة پروتئني كه شامل پروتئينهاي محلول در بافر مي باشد در يك بشر يك ليتري خالي شد و رسوب بدست آمده دور ريخته شد
رسوبدهي پروتئينها حلاليت و پايداري پروتئينها در محلولهاي آبي بسيار با اهميت است و از ملزومات استخراج پروتئينها از منبع زنده به شمار مي آيند مناسبترين ميانكنش بين پروتئين با ديگر مولكولها يونها و حلالهاي آبي از طريق گروههاي آبدوست سطح پروتئين تأمين ميشود پروتئينها براساس تركيب آمينواسيدهاي تشكيل دهنده كمترين حلاليت در آب را در نقطه ايزوالكتريك PI خود دارند رسوب پروتئين هاي موجود در عصارة آبي با استفاده از عواملي چون افزودن نمكها حلالهاي آلي يا پليمرهاي آلي تغيير pH و دماي محلول امكان پذير است در طي عمل رسوبدهي پروتئنها به منظور جلوگيري از غير طبيعي شدن پروتئينها استفاده از دماهاي پائين بين 40 درجه سانتيگراد ضروري مي باشد علاوه بر اين هنگامي كه رسوبدهي پروتئينها با استفاده از حلالهاي آلي همچون اتانل يا استن انجام مي شود‌بعلت كاهش يافتن نقطة‌انجماد محلول دماهاي زير صفر درجة سانتيگراد نيز مي تواند بكار رود اما استفاده از اين حلالها خطر غير طبيعي شدن پروتئينهاي عصاره را بالا مي برد پليمرهاي ارگانيك همچون پلي اتيلن گلايكول PEG همانند حلالهاي آلي بواسطة جانشيني به جاي مولكولهاي آب موجب كاهش در حلاليت پروتئينها مي گردند امتياز PEG نسبت به حلالهاي آلي كنترل ساده تر و ارزان بودن آن است ولي برداشت آن از محلول پروتئيني مشكل مي باشد
تغيير pH بعنوان يك روش ساده و ارزان براي رسوبدهي پروتئينها بكار مي رود بطوريكه در نقطة pH=pI پروتئينها بسادگي از يك محلول آبي رسوب مي نمايند اين روش وابسته به قدرت يوني است به نحوي كه اتصال يونها به پروتئينها نقطه ايزوالكتريك آنها را تغيير مي دهد بعلاوه در محلولهاي نمكي با ثابت نگهداشتن غلظت نمك مي توان با تغيير دماي محلول پروتئينها را رسوب داد در محلولهاي آبي پروتئينها همچون مولكولهاي ديگر با پيوندهاي كم و بيش قوي مولكولهاي آب در يك ساختار منظم احاطه مي شوند آب بدليل ثابت دي الكتريك بالا يك حلال عمومي براي پروتئينها محسوب مي شود و چنين كميتي با افزودن يونهايي همچون غلظتهاي پائين Nacl به آب افزايش مي يابد شكل 3 از اين رو غلظت و نوع يونها بواسطة تغيير در ساختار و خواص آب بر روي حلاليت پروتئينها تأثير مي گذارد اين اثرات اغلب با مراجعه به يونهاي Lyotrop Series Hofmeister Series توضيح داده ميشود
اولين يونهاي هر سري ساختار آب را مي گسلد و حلاليت پروتئينها را كاهش مي دهد Salting out effect ولي يونهاي آخر معمولاً حلاليت مولكولهاي غير قطبي را افزايش مي دهند Salting in effect اين بدان معني است كه نمكهاي مختلف با اثر تركيبي آنيونها و كاتيونهاي اين سري بر روي حلاليت پروتئينها اثر مي گذارند جزء بندي پروتئينها با نمك آمونيوم سولفات عصارة خام حاصل از مرحله استخراج پروتئين ها به منظور كاربرد مستقيم بر روي ستونهاي كروماتوگرافي مناسب نيست بنابراين روشي لازم است تا علاوه بر آنكه عصاره را تغليظ كند بيشترين حجم پروتئينها را نيز برداشت نمايد نمك آمونيوم سولفات معمولترين نمك بكار رفته جهت رسوبدهي جزئي پروتئينها مي باشد اين نمك با افزايش اثر آب گريزي در محلول موجب تجمع پروتئينها از طريق سطوح هيدروفوبيك و در نتيجه رسوب آنها مي گردد در اين روش ابتدا پروتئينهاي حجيم با يكديگر رسوب مي كنند و به اين ترتيب بخشي از پروتئينهاي اضافي حذف مي شوند سپس در مرحلة بعد رسوبگيري پروتئين مورد نظر مي تواند از مادر آب بدست آمده رسوبگيري شود
غلظت نمك آمونيوم سولفات مورد نياز براي رسوبدهي بصورت درصد اشباع بيان ميشود كه وابسته به دماست منحني تيپيك رسوبدهي پروتئينها با آمونيوم سولفات را نشان مي دهد به ترتيبي كه با هر مرحله افزايش غلظت نمك مقدار پروتئين رسوب داده شده تغيير مي نمايد مزيت استفاده از نمك آمونيوم سولفات بعنوان يك عامل رسوبدهندة در اين است كه خطر غير طبيعي شدن پروتئينها پائين بوده و پس از رسوبگيري رسوب به سهولت در محلولهاي آبي قابل حل مي باشد اما محلول پروتئيني حاصل نياز به دياليز شدن دارد تا قدرت يوني مناسب براي كاربرد در كروماتوگرافي تعويض يون را پيدا نمايد روش رسوبدهي جزئي پروتئينها رسوبدهي پروتئينهاي موجود در عصارة قارچ در دو مرحله 35% و 75% اشباع نسبت به نمك آمونيوم سولفات انجام شد كه مراحل آن بشرح ذيل است مرحله اول اشباع 35 درصد آمونيوم سولفات با توجه به جدول رسوبدهي پروتئينها با نمك آمونيوم سولفات جدول پيوست در دماي صفر درجة سانتيگراد به ازاي هر يك ميلي ليتر از عصاره g 197/0 نمك آمونيوم سولفات وزن شده و به تدريج به عصارة پروتئيني اضافه گرديد
محلولهاي رنگاميزي ژل پلي آكريل آميد
اثرات نمك بر روي حلاليت پروتئين ها
اندازه گيري مقدار پروتئين
الكتروفورز در ژل پلي آكريل آميد PAGE